含紅色染料的 RedMasterMix （2x） Taq PCR MasterMix  產(chǎn)品編號(hào)： M3029.0100

優(yōu)勢(shì)一覽

• 輕松跟蹤移液步驟

• 穩(wěn)健的性能 – 高度穩(wěn)定的 PCR 預(yù)混液

• 菌落篩選 – 針對(duì)快速篩選進(jìn)行了優(yōu)化

• 無(wú)需額外步驟 – 已包含上樣緩沖液

• 方便的規(guī)格 – 1.5 mL 等分試樣大小，易于作

規(guī)格：
用于 PCR 的 2 次即用型預(yù)混液，包括用于更好地觀察移液的紅色染料和凝膠上樣染料。已包括 dNTP、緩沖液和 DNA 聚合酶。

方便的等分試樣大小：1.25 mL。該預(yù)混液在 +2°C 至 +8°C 下可穩(wěn)定保存至少 8 個(gè)月。

用于小鼠尾巴的可靠 PCR。用于 Sanger 測(cè)序反應(yīng)。

One unit is defined as the amount of enzyme which will convert 10 nmoles of dNTPs to an acid-insoluble form in 30 min at 72°C under the assay conditions (25 mM TAPS (tris-(hydroxymethyl)-methyl-amino-propanesulfonic acid, sodium salt) pH 9.3 (25°C); 50 mM KCl; 2 mM MgCl2; 1 mM b-mercaptoethanol; and activated calf thymus DNA as substrate.

synthetic

Sicherheits Hinweise / Safety

Klassifizierungen / Classification

eclass-Nr: 32-16-05-02

技巧

對(duì)于每個(gè)模板/引物對(duì)，必須憑經(jīng)驗(yàn)評(píng)估最佳反應(yīng)條件，例如通過(guò)改變引物與模板的比例或離子強(qiáng)度（使用 MgSO4）和循環(huán)參數(shù)（時(shí)間和溫度）。

DNA 模板

• GENAXXON Red 預(yù)混液特別適用于不太干凈的鼠尾 DNA

• 關(guān)于 10E4需要靶 DNA 的拷貝才能在 25-30 個(gè)循環(huán)后獲得可檢測(cè)的產(chǎn)物。

• 使用 1pg–1ng 質(zhì)粒 DNA 或病毒 DNA。

• 使用 1ng–1 μg 用于基因組 DNA。

• 較高的 DNA 濃度會(huì)降低擴(kuò)增子特異性，并導(dǎo)致額外的條帶，尤其是當(dāng)使用大量循環(huán)時(shí)。

• 如果需要較少的循環(huán)次數(shù)，例如為了提高特異性，可以使用更高的 DNA 濃度。

底漆

• 一般來(lái)說(shuō)，這些應(yīng)該有 20-30 個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。

• 理想的 GC 含量為 40-60%。

• GC 堿基應(yīng)盡可能均勻地分布在引物上。

• 引物對(duì)的兩種引物的熔解溫度相差不應(yīng)超過(guò) 5°C。

• 避免引物內(nèi)的二級(jí)結(jié)構(gòu)（例如發(fā)夾）以及所用引物對(duì)之間潛在的二聚化區(qū)域。

• 如果將轉(zhuǎn)基因位點(diǎn)（側(cè)面定向誘變）摻入引物中，那么最好在距離側(cè)面定向誘變位點(diǎn) 5' 處插入 4-6 個(gè)額外的堿基，以便引物可以在正確的位置退火。

• 每種引物的最終濃度應(yīng)在 0.05-1 μM 之間（0.05 μM 是下限），典型值在 0.1 至 0.5 μM 之間。

• 較高的濃度會(huì)導(dǎo)致引物二聚化增加，并“產(chǎn)生"或模擬假擴(kuò)增產(chǎn)物。

• 在引物和探針的情況下，可以假設(shè)隨著引物量的增加，PCR 一開(kāi)始當(dāng)然也會(huì)運(yùn)行得更好（通常一開(kāi)始會(huì)預(yù)期 Ct 值會(huì)更早）。然而，隨著濃度的持續(xù)增加，PCR 達(dá)到飽和。除了略低的 Ct 值外，熒光信號(hào)通常也在開(kāi)始時(shí)以較高的引物/探針濃度被放大。

• 此外，可以添加一個(gè)或多個(gè)探針（應(yīng)始終充分測(cè)試必要的濃度）。我們建議在 50-500 nM 之間。在這方面，應(yīng)測(cè)試不同的組合。

鎂濃度

• 1.5-2.0 mM Mg2 + 是 Taq DNA 聚合酶作用的選擇，但最佳 Mg2 + 濃度在很大程度上取決于模板、緩沖液組成、DNA 量以及 dNTP，因?yàn)楹髢烧哂绕渚哂序湘V的高傾向，從而將其從 PCR 反應(yīng)中吸收。

• 如果 [Mg2+] 太低：不可見(jiàn) PCR 產(chǎn)物。

• 如果 [Mg2+] 過(guò)高：可以看到不需要/不正確的 PCR 產(chǎn)物。可能只能看到涂片。

脫氧核苷酸 （dNTPs >）

• 典型濃度為 200 μM 每個(gè)單獨(dú)的 dNTP。然而，原則上，200-400 μM 的 dNTP 是 PCR 的良好濃度。

• 50-100 μM 的較低濃度會(huì)增加特異性，但在某些情況下會(huì)顯著降低產(chǎn)量。

• 較高的濃度會(huì)增加產(chǎn)量，尤其是對(duì)于長(zhǎng)擴(kuò)增子，但會(huì)顯著降低特異性。

DNA 聚合酶

• 選擇正確的聚合酶取決于預(yù)期用途和所使用的模板（標(biāo)準(zhǔn) PCR：高準(zhǔn)確度的 Taq DNA 聚合酶 S >，高產(chǎn)量的 Taq 聚合酶 E >;預(yù)混液：標(biāo)準(zhǔn) PCR MasterMix > 或 Red MasterMix >含紅色染料）。

• 對(duì)于多重 PCR，有特殊的凍干多重 MasterMixe >。

• 為了提高特異性或?qū)τ诶щy的模板，建議使用熱啟動(dòng)應(yīng)用程序。為此，>有特殊的熱啟動(dòng)聚合酶。

• 對(duì)于用于克隆或其他需要低錯(cuò)誤率的方法的 PCR，熱穩(wěn)定的高保真校正聚合酶，如
  Pfunds >、ExactRun >、ReproFast > 或 ReproHot （KOD） 校正聚合酶>。這些酶在擴(kuò)增過(guò)程中的錯(cuò)誤要少得多，并增加了無(wú)錯(cuò)誤擴(kuò)增子的機(jī)會(huì)。

• 對(duì)于基因分型和其他需要高鑒別度的應(yīng)用，有一種新型高選擇性 DNA 聚合酶 SNP Pol DNA 聚合酶 >。它特異性地區(qū)分錯(cuò)配的引物模板復(fù)合物，并特異性地僅提供具有*全匹配引物對(duì)的 PCR 產(chǎn)物。

• 對(duì)于實(shí)時(shí)定量 PCR >，有高度專(zhuān)業(yè)化的 qPCR 預(yù)混液。在這里，選擇合適的預(yù)混液取決于所使用的 qPCR 設(shè)備。例如，重要的是要注意 qPCR 預(yù)混液中是否應(yīng)包含 ROX 以及應(yīng)包含多少 ROX，以及它是帶有綠色熒光染料>的 Green qPCR Mastermix 還是不含熒光染料的 Probe qPCR MasterMix >。也可提供在室溫下穩(wěn)定的微珠凍干 （LyoBalls >）。

• PCR 反應(yīng)中使用的 DNA 聚合酶量會(huì)顯著影響 PCR 結(jié)果（對(duì)于 50 μL 方法，使用 1.25 - 1.5 單位 Taq 聚合酶>）。

退火

• 退火溫度應(yīng)通過(guò)溫度梯度進(jìn)行優(yōu)化。退火期也會(huì)影響成功。確實(shí)，使用不同的預(yù)混液或使用其他供應(yīng)商的反應(yīng)緩沖液會(huì)對(duì)退火溫度產(chǎn)生嚴(yán)重影響。

• 引物對(duì)的兩種引物的熔解溫度相差不應(yīng)超過(guò) 5°C。

• 典型的退火溫度比所用引物的*低 Tm 低約 5°C。溫度通常下降到 50-60°C 之間。

• 如果存在非特異性條帶或潤(rùn)滑，則應(yīng)測(cè)試更高的退火溫度。

• 典型的退火時(shí)間在 15-30 秒范圍內(nèi)。

延伸溫度和時(shí)間

• 擴(kuò)增子延伸通常在 68°C 下進(jìn)行。

• 作為一般規(guī)則，可以假設(shè)每 1000 個(gè)堿基對(duì)的標(biāo)準(zhǔn) Taq 聚合酶在 68°C 下的延伸時(shí)間為 1 分鐘（或 2000 個(gè)堿基對(duì)為 2 分鐘，或 3000 個(gè)堿基對(duì)為 3 分鐘）。

• 對(duì)于小于 1 kb 的 PCR 產(chǎn)物，可以采取 45-60 秒（如果不是接近 1 kb 的擴(kuò)增子，則更像是 45 秒）。

• 超過(guò) 3000 個(gè)堿基對(duì)的 PCR 產(chǎn)物和超過(guò) 30 個(gè)循環(huán)的 PCR 方案都可能需要更長(zhǎng)的延伸時(shí)間。因此，應(yīng)再次優(yōu)化更長(zhǎng)的擴(kuò)增子或更高的循環(huán)數(shù)。

擴(kuò)增具有高 GC 含量、強(qiáng)二級(jí)結(jié)構(gòu)、低濃度或大于 5 kb 的擴(kuò)增子的模板通常需要優(yōu)化 PCR 條件。通常，在 PCR 過(guò)程中應(yīng)在 95°C 下進(jìn)行 15-30 秒的變性。

上海牧榮生物科技有限公司 是一家專(zhuān)注于分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、細(xì)菌學(xué)、遺傳學(xué)、免疫學(xué)、生物化學(xué)、蛋白質(zhì)學(xué)、細(xì)胞治療、臨床應(yīng)用等領(lǐng)域，以銷(xiāo)售為主的生物技術(shù)公司。銷(xiāo)售的產(chǎn)品涉及，細(xì)胞株和菌株、胎牛血清、生化試劑、ELISA試劑盒、抗體和抗原、細(xì)胞因子、技術(shù)服務(wù)、實(shí)驗(yàn)耗材和消耗品、儀器設(shè)備等。客戶(hù)遍布大學(xué)、研究所、醫(yī)院、衛(wèi)生防疫、商品檢驗(yàn)檢疫、制藥公司、生物技術(shù)公司和食品工業(yè)等單位。

含紅色染料的 RedMasterMix （2x） Taq PCR MasterMix